氨基酸总量怎么测定(考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度)

考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度的优缺点

实验原理

考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质中的碱性氨基酸(特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基与考马斯亮蓝G-250染料在碱性条件下可以结合的原理，使染料的最大吸收峰位置由465 nm变为595 nm，溶液颜色也由棕黑色变为蓝色，这样通过分光光度法可以定量测定微量蛋白的浓度。这种蛋白质测定法快速、灵敏，是目前灵敏度最高的蛋白质测定方法。

材料与仪器

1.仪器

• 10 mL试管6个
• 试管架1个
• 0.5 mL、1 mL、5 mL移液管分别2个
• 恒温水浴箱
• 分光光度计

2.材料与试剂

• 待测蛋白质溶液:白菜匀浆液
• 考马斯亮蓝试剂:考马斯亮蓝G-250 100 mg溶于50 mL 95%乙醇中，加入100 mL 85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000 mL。
• 标准蛋白质溶液:结晶牛血清蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白质含量，根据其纯度用0.15 mol/L NaCI配制成1 mg/mL蛋白溶液。

操作步骤

(1）白菜匀浆液的制备:称取5g白菜叶，用水洗净，吸干表面水分，剪碎，加入0.05 mol/L Tris-HCl, pH 7.4 磷酸盐缓冲液PBS，0℃~4℃下冰浴研磨15～20 min，12000 r/min冷冻离心10 min，上清即为白菜叶的溶性蛋白溶液。

(2）制备标准曲线:按照下表所示条件进行混合摇匀后，在25℃下保温10 min，静置5min，以第一管为空白，在波长595 nm下测定其吸光度值，以标准蛋白的浓度对应吸光度值做线性回归方程。

(3）样品中蛋白质的测定:样品适当稀释后，另取一干净试管，加入稀释样品1.0 mL及考马斯亮蓝试剂5.0 mL，混匀，在25℃下保温10 min后，静置5 min，于波长595 nm下测定其吸光度值，代入标准曲线中，计算出蛋白质的含量。

注意事项

（1）合理稀释待测蛋白溶液，使测定值在标准曲线的线性范围内。

（2）控制好平行之间的标准误差。分光光度计检测吸光度时，至少设置两个平行孔，取平均值。

（3）正确使用分光光度计。

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