抗体氨基酸测序
抗体的筛选
自 1986 年第一个鼠源单克隆抗体药物OKT3上市以来，截止2021年底，FDA共批准了超过100款抗体药物，每年批准的抗体药物约占据批准新药的五分之一。抗体药物因为具有高特异性，低不良反应的特征，已成为近年来开发的主要一类新药。随着大分子药物的不断发展，抗体药物的重要性随之提升，市场需求亦逐年扩容，应运而生的抗体筛选技术的发展也是日新月异。
杂交瘤细胞筛选单克隆抗体
单克隆抗体技术的诞生正式开启了抗体药物领域的蓬勃发展。1975 年，英国剑桥大学MRC 实验室的 Milstein 和 K?hler 将具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞和能够分泌抗体的小鼠 B细胞融合后获得了能够传代培养和持续分泌单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞[1]。二人因为发明了单克隆抗体制备技术而获得了1984年诺贝尔生理学或医学奖。相比于多克隆抗体，单克隆抗体具有高度的抗原识别特异性和蛋白生产的均一性，因其能够特异性的靶向结合多种疾病治疗的致病原，而被形象的称为 magic bullet[2]。单克隆抗体制备方法不仅加快了生命科学和医学的发展进程，而且成为现代生物医药产业的核心技术，目前已经广泛应用于研究工具、诊断试剂和抗体药物等制造领域，在疾病治疗与科学探索等方面广泛造福人类。
上图所示为杂交瘤技术生产单克隆抗体的流程图
杂交瘤细胞所生产的鼠源单克隆抗体在应用到人体之后极易引起免疫系统的排斥反应，产生人抗鼠抗体。在基因工程技术兴起之后，多种鼠源抗体的人源化改造技术相应被开发出来。最早的是将鼠源抗体的恒定区替换成人源抗体的恒定区形成人-鼠嵌合的抗体。此后为了进一步降低抗体中的鼠源成分，研究者直接将鼠源抗体可变区中结合靶点的氨基酸序列嫁接到人源抗体的的可变区序列中形成人源化抗体[3]，这一类抗体也是目前绝大多数获批抗体药物的类型。随着技术的不断发展，单克隆抗体的发展已经进入到全人源抗体的开发领域。其中的技术代表有很多种，包括组合抗体库技术、人源抗体转基因小鼠、人单 B细胞测序技术等等。
抗体库技术筛选抗体
20世纪90年代，组合化学技术与基因工程抗体技术相互结合产生了抗体库技术，从此抗体工程技术进入了一个新的发展阶段。抗体库技术简单来说就是通过基因工程的手段将人体 B淋巴细胞内所有的抗体可变区基因扩增出来，构建体外的抗体基因文库。随后利用各种抗体展示技术实现基因-蛋白之间的翻译而表达出相应的抗体。最后通过和抗原的相互作用筛选出特异性结合的抗体，再测序得到相应的抗体基因。根据使用的筛选技术的不同，抗体库技术经历了组合抗体库、噬菌体表面展示抗体库、细胞表面展示抗体库三个发展阶段。
组合抗体库技术
组合抗体库技术是通过DNA重排将个体B细胞免疫系统的抗体多样性集合及其抗体应答历史在试管中重构，随机组合并再现的方法[4]。组合抗体库可以极大地简化抗体发现过程，也可以记录个体的抗体反应历史。自20世纪80年代该技术面世以来，已有超过70种单克隆全人源抗体进入临床研究，14种已获批准。
左图显示了脾B细胞1亿个细胞中6个代表细胞的组织，每个细胞都含有不同的抗体。每个细胞都有一个独特的重链和轻链组合。
右图描述了组合抗体库是由随机分类的抗体重链和轻链组成的关键原理，其中由原始细胞包装的原始抗体组合已被破坏。
噬菌体表面展示抗体库技术
组合抗体库技术出现后不到一年，即被噬菌体抗体库技术所代替，该技术是在噬菌体表面展示技术基础上建立起来的，是迄今为止，发展最成熟、应用最为广泛的抗体库技术。噬菌体表面展示技术，通过抗体和噬菌体表面纤毛蛋白的融合表达将抗体展示在噬菌体的表面，利用噬菌体和抗原的亲和筛选可以得到与抗原特异性结合的抗体[5]。使用该技术陆续已经构建成功了天然抗体库、免疫抗体库、半合成抗体库和全合成抗体库，并能够从中筛选出功能抗体的基因。
A.感兴趣的基因（粉红色）被克隆到噬菌体DNA的基因3蛋白(g3p)中，导致粉红色蛋白产物（抗体或肽）作为一种多肽融合的形式展示在噬菌体表面。
噬菌体展示技术的筛选步骤：
① 一个包含106~1011个克隆的噬菌体文库与固定的抗原孵育。
② 未结合的噬菌体通过清洗被弃去。
③ 与抗原结合的噬菌体被洗脱下来。
④ 洗脱下来的噬菌体在辅助噬菌体的帮助下感染大肠杆菌从而扩增洗脱下来的候选噬菌体。
⑤ 将大肠杆菌细胞种在可筛选的平板上并进行扩增。
以上步骤重复2~3次，使得与抗原结合的噬菌体被富集。
细胞表面展示抗体库技术
为了解决蛋白在噬菌体表面展示中无法有效折叠和没有翻译后修饰的问题，陆续开发了一些基于细胞的筛选技术。依赖于在细胞表面以功能形式存在的抗体或抗体片段的多拷贝展示，随后进行高通量筛选。基于细胞的筛选具有单细胞分析和独立候选文库表征的好处[6]。在基于细胞的筛选中，最常用的方法是流式细胞术，它允许根据细胞的大小、颗粒度和荧光特性，每分钟分析数十万个细胞。呈现在细胞表面的单克隆抗体可以通过抗体表达水平、展示强度或抗原亲和力来进行筛选。
酵母展示技术首次是在Wittrup组中被开发，将外源蛋白基因与特定的载体基因融合后导入酵母细胞，融合蛋白含有可锚定在酵母细胞壁上的结构，经转录翻译后可将外源蛋白固定化表达在酵母细胞表面，结合流式细胞术来筛选目标抗体。
上图所示为酵母展示技术示意图
a) 感兴趣的蛋白两侧有两个表位标签：一个9个氨基酸的血凝素抗原(HA)标签和一个10个氨基酸的c-myc标签，并融合到α-凝集素Aga2p亚基的C端。
b) 酵母细胞表面的蛋白展示：翻译后，69个氨基酸的Aga2p亚基通过两个二硫键与725个氨基酸的α-凝集素Aga1p亚基结合。融合蛋白随后被分泌到细胞外空间，Aga1p通过β1,6-葡聚糖共价连接而被固定在细胞壁上。因此，感兴趣的蛋白被展示在细胞表面，可被可溶性配体利用。
除此之外，还有哺乳动物细胞表面展示、无细胞体系的核糖体展示等技术被提出用于全人源抗体文库的构建和筛选。
目前，使用抗体库技术不仅可以筛选特异性的抗体片段，而且还能够对已有的抗体分子进行改造，如降低抗体鼠源性、提高抗体亲和力和稳定性等。后者又被称为抗体定向进化，而所使用的抗体库被称为定向进化抗体库。随着科学的进步和技术的发展，相信未来会有更多具有针对性和差异性的抗体筛选技术被开发出来。
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