氨基酸水解图
用于蛋白质氨基酸组成测定的水解方法
今天，我们通过5个食品样本的分析案例给大家分享一下如何通过高效液相色谱法对17种水解氨基酸进行测定：
一、实验方法及原理
试样经酸水解得各种氨基酸后,经高效液相色谱在线衍生检测分析外标法定量测定氨基酸酸的含量。
二、实验步骤
2.1主要实验仪器? ???
HPLC（紫外检测器，在线衍生）
离心机（12000rpm）
天平（0.01g，0.1mg）
超声波清洗机（240w）
干式氮吹仪（100℃）
烘箱（105℃，115℃）
2.2 实验步骤
1、 水解：
准确称取一定量试样（精确至0.0001g），使试样中蛋白质含量在10mg~20mg范围内。将称量好的样品置于水解管中。根据试样的蛋白质含量，在水解管内加10mL~15mL6M盐酸溶液。用氮气置换管内空气后密封。
2、 水解管在115±5℃烘箱中水解22~24h后放至室温，取出水解液，用0.22μm孔径的滤膜过滤，取1ml续滤液至进样小瓶中，100℃氮吹干后用0.1M的HCL水溶液超声溶解固体物质，取溶液直接进样。（根据实际浓度可以用0.1M的HCL水溶液适当稀释，一般植物均可用1mL 0.1M HCL水溶液稀释）
3、 标准溶液配制：
购买市售标准溶液（10pmol/μL、25pmol/μL、100pmol/μL、250pmol/μL、1000pmol/μL）。
2.3 色谱条件
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参数 |
值 |
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色谱柱 |
AdvanceBio AAA C18，4.6 × 100 mm, 2.7 μm |
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流速 |
1.5 mL/min |
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柱温 |
40 °C |
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流动相 |
A) 10 mmol/L 磷酸氢二钠和 10 mM 硼酸钠溶液，用盐酸将 pH 调节为 8.2 B) 甲醇:乙腈:水，45:45:10 (v:v:v) |
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梯度程序 |
时间 (min) %B 0.0 2 0.35 2 15.7 100 15.8 2 18.0 2 |
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检测器 |
338 nm，带宽 10 nm；参比 390 nm，带宽 20 nm（一级氨基酸） 262 nm，带宽 16 nm；参比 324 nm，带宽 8 nm（二级氨基酸） |
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进样程序 |
? 吸取 2.5 μL 硼酸盐缓冲液（1号瓶） ? 吸取 1.0 μL 样品 ? 在清洗口将 3.5 μL 混合液混合 5 次 ? 等待 0.2 分钟，然后吸取 0.5 μL OPA（2号瓶） ? 在清洗口将 4 μL 混合液混合 10 次 ? 吸取 0.4 μL FMOC（3号瓶） ? 在清洗口将 4.4 μL 混合液混合 10 次 ? 吸取 32 μL 稀释剂（4号瓶，此步骤一般情况不使用） ? 在清洗口将 20 μL 混合液混合 8 次 ? 进样 ? 等待 0.1 分钟 ? 阀切换至旁路 |
2.4 测定方法
依据保留时间一致性进行定性识别，曲线外标法定量。根据标准样品的保留进间确定样品中目标物的色谱峰。以标准样品目标物的峰面积为纵坐标、浓度（单位：mg/L）为横坐标拟定曲线。再根据样品中目标物峰面积计算得出样品中目标物的浓度，从而计算样品中目标物的含量。
2.5 计算方法
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