掌握这些技术，基因克隆不是梦
在过去的几十年里,分子生物学家已经开发许多可以用来更快地构建目的DNA序列结构的技术来简化和规范克隆过程。
你熟悉这些克隆技术吗?下面我们来看看这些技术的特点。
1, 限制性酶切与连接法
长期以来，限制酶切与连接法被认为是一种传统的克隆方法。这个方法便宜灵活，可以分为两步过程：酶切和连接。限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA片段上并切割双链DNA。DNA连接酶催化两双链DNA片段相邻的5’-磷酸和3’-羟基间形成磷酸二酯键。在分子克隆中，最有用的DNA连接酶是来自T4噬菌体的DNA 连接酶：T4 DNA连接酶。这个方法原理较简单，我不做过多介绍。
2, Gateway 克隆技术
Gateway克隆发明于九十年代末，由walhout[2]等提出，一种通用性的克隆方法，与传统克隆方法相比，Gateway技术的优点是可以不必考虑目的DNA 是否有合适的酶切位点，也不必进行繁琐而费时费力的酶切和连接反应，就可以按确定的方向和读码框快速而准确地将目的基因克隆到各种与Gateway技术兼容的目的载体上。
它利用λ噬菌体与大肠杆菌染色体之间发生的位点特异性的重组整合与切除反应，即LR和BP。BP反应是利用一个attB DNA片段或表达克隆和一个attP供体载体之间的重组反应，创建一个入门克隆。LR 反应是一个attR入门克隆和一个attR目的载体之间的重组反应。LR反应用来在平行的反应中转移目的序列到一个或多个目的载体。重组位点attB、attP、attL和attR 由噬菌体λ和大肠杆菌编码的酶合剂特异识别。
Invitrogen公司开发了包括运用于原核、酵母、昆虫和哺乳动物等不同宿主的表达载体，大大提高了Gateway技术的适用性。Gateway技术已被广泛用于高通量载体的构建
3, Gibson Assembly
传统的限制性内切酶克隆技术，会在两个片段的结合位置上形成一道“疤”或“缝”，这种瑕疵可能会对DNA片段的行为产生微妙的影响。这一点特别令合成生物学家头疼，因为他们常常要将启动子和终止子这样的DNA片段转变为可预测的独立元件。Now我给大家介绍一下Gibson Assembly，一种无缝克隆方法。
Gibson组装最早由Daniel Gibson博士和他的同事J. Craig Venter在2009年提出[3]。Gibson组装非常适合用于拼接多个线性DNA片段，当然也适合将目的DNA插入载体中。如下图所示，首先，需要在DNA片段的末端加上同源片段（通过PCR法加上）；然后，将这些DNA片段和一种master mix（含有三种酶）混合孵育一个小时就可以了。这种master mix含有三种不同类型的酶：1）一种外切酶，从5’端开始对DNA进行消化，产生长的黏性末端，这样便于与另外的同源末端进行配对结合。2）一种聚合酶，用于修补gap。3）一种DNA连接酶，实现无痕拼接，形成完整的DNA分子。
这个系统最厉害的是，这三种酶都可以在同一个温度下很好的发挥功能，所以整个反应在50摄氏度条件下一个小时就可以完成。一小时后，样品可以直接用于转化。当然Gibson Assembly也有缺陷，这一过程并没有生成限制性酶切位点，因而不方便将拼接片段转移到另一个载体上。建议最好是事先设计好限制性位点。需要注意的是，如果一次性组装超过5个片段，成功率会大大降低。
4, Golden Gate 拼装法
Golden Gate 拼装法主要是依赖于一种II型限制性内切酶(ⅡS 型酶，如 BsaⅠ和 AarⅠ)，这种酶能够在其DNA 识别处的相邻位置进行剪切[4]。如果人为设计识别位点不同的相邻序列，就可利用同种限制酶产生不同的粘性末端，从而一次组装多个片段，这克服了传统多片段组装时限制酶种类的限制。
具体到原理：一般的内切酶分为三种，通常用的是2类的酶，识别特定的回文序列，并从中切开。而golden gate一般用的是3类酶，一般以bsmb 1，Bsa1, Bbs1这三种酶，识别特定的序列，并在特定序列以后隔几个任意的碱基切开，这样子就可以克服2类酶必须要回文序列才能用的缺点，实现片段的连接。
另外，要说的是连接部分，传统的连接酶是T4用的比较多，T4可以连接黏性末端跟平末端，而golden gate里用的是T7，它的特点是只能实现连接黏性末端。因为T7的这一特性，所以在连接的时候可以把片段跟切好的载体混到一种特殊的buffer里，在这里内切酶跟T7都可以保持比较高的活性，通过温度的调节，实现克隆的构建。因为用的是T7，所以不用担心PCR片段自连降低克隆效率，又因为是用的三类酶，可以通过黏性末端的设计，可以一种酶切多个片段，又不用担心这几个片段之间的乱连，来达到分子克隆的目的[5]。
5, TOPO克隆(TA克隆)
TOPO克隆使用DNA拓扑异构酶I，该酶同时具有限制酶和连接酶的特性。这种酶在复制期间切割并重新连接DNA，整个克隆过程可以在室温下完成，且仅需5分钟。TOPO克隆不需使用含限制酶序列的引物，不需在PCR扩增产物上加接头，即可直接进行克隆。
Topo TA克隆原理与TA克隆一样，唯一不同的是TA克隆用的是T4连接酶把PCR片断连接到T载体上，而Topo TA Cloning用的是DNA 拓扑异构酶I。
pCR-TOPO 载体也是一种 T 载体，只是在其 3’末端的突出 T 上共价结合了一个拓扑异构酶 Ⅰ ，当带 3′ 末端的突出 A 的 PCR 产物与该 T 载体互补配对时，拓扑异构酶 Ⅰ 就将该缺口连接起来。
自沃森，克里克在1953年发现DNA双螺旋结构不过60余年，如今的DNA克隆技术却已发展到如此的程度。合成生物学正处在高速发展时期，这些进步技术的进步必将推动生物革命浪潮的到来。你都掌握了吗？
Reference
[1] 李华琴,林陈水,张文倩. 不依赖连接反应的高通量克隆方法. 氨基酸和生物资源.2013,35(4):43-46
[2] Walhout A J M, Temple G F, Brasch M A, et al. GATEWAY recombinational cloning: Application to the cloning of large numbers of open reading frames or ORFeomes[J]. Methods in enzymology, 2000, 328: 575-IN7.
[3] Gibson, D.G., et al. (2009) Nat. Methods 6, 343-345.
[4] Morbitzer R, Elsaesser J, Hausner J, et al. Assembly of custom TALE-type DNA binding domains by modular cloning[J]. Nucleic acids research, 2011, 39(13): 5790-5799.
[5]
Amino Acids & Biotic Resources影响因子？
一、氨基酸和生物资源 Amino Acids and Biotic Resources 本刊是我国唯一一种以生物资源为主题，氨基酸为特色的科技期刊。分为生物资源研究、保护与利用；农副资源研究与利用；生物技术及制品；氨基酸生产技术；氨基酸和生物资源与人类健康；分析检测技术；氨基酸应用；生物产业和生命科学工作者等8个栏目。在生命科学、资源科学、生物工程、饲料科学、食品科学、医药学、营养学等领域深受欢迎。本刊被国内许多文摘和数据库所收录。读者主要为科技工作者、大中专院校师生、技术人员和工人等。 二、基因组蛋白质组与生物信息学报（英文版）Genomics、Proteomics Bio.rmatics Genomics, Proteomics Bio.rmatics (《基因组蛋白质组与生物信息学报》，简称GPB)创刊于2003年，是由中国科学院北京基因组研究所主办、科学出版社出版的国家级英文学术期刊，由杨焕明教授、于军教授担任主编，汪建教授、贺福初院士担任副主编。本刊主要刊载基因组学、蛋白质组学、生物信息学及其相关领域的研究进展、综述、研究论文、实验技术与方法、研究快讯等高质量的稿件，突出刊物的学术性、前沿性、指导性和实用性。本刊读者对象为基础医学、生命科学、农学、计算机科学领域的科研与教学人员、研究生等，以及数学、物理学领域对生物科学有兴趣的研究者。 三、生命科学 Chinese Bulletin of Life Sciences 本刊以评述、综述、研究简讯（动态）等形式报道国内外生命科学研究的发展趋势、学术动态和研究成果，重点报道生命科学领域的评述性或综述性文章和国家自然科学基金资助的生命科学有关的项目介绍、研究进展、管理经验和问题咨询，同时也报道该领域的研究动态、研究成果、科学家介绍、研究机构介绍和书评等内容。 四、生命科学研究 Life Science Research 本刊是中国以生命科学命名的唯一的全国综合性学术期刊。主要反映世界各国生命科学领域中的最新研究成果，所刊登的论文90%来源于中国国家自然科学基金、国家科技部重大项目基金以及省级科学基金。经过专家评审，论文达到国家先进水平及国内外先进水平的共占85%以上。《生命科学研究》严格执行 ISO8，ISO31，ISO1000，ISO5966等国际标准，遵守国际惯例，逐步实现编排格式国际标准化，1999年被湖南省评定为科技学术类一级期刊，2000年被评为全国CAJ-CD规范执行优秀奖。 五、中国生物工程杂志 China Biotechnology 本刊由中科院文献情报中心和国家科技部中国生物工程开发中心共同主办，是我国生物工程领域全国性学术团体、国家一级学会——中国生物工程学会会刊。《中国生物工程杂志》(月刊)内容涉及医药生物技术、农业生物技术、轻化工生物技术、环境生物技术、海洋生物技术等专业领域。设有学术论文、研究进展、研究报告、专题论述、技术与方法、评论、新闻报道、生物工程领域知识产权研究、市场与商情、会议消息、动态等栏目，还以杂志专集、增刊等的形式出版生物工程专题著述。本刊创刊于1976年，是我国最早创刊的中央级综合性生物工程专业刊物，编辑委员会由国内知名生物工程专家、管理部门领导组成，发行面覆盖全国各省、自治区、直辖市、香港、台湾及海外有关大学、研究机构、图书馆也有相当的订户，和海外建立有广泛的刊物交换联系并被国内外著名检索系统收录。 希望我的回答可以为你提供一些帮助O(∩_∩)O~
回答时间：2011-10-24 3:01:16
氨基酸资源和生物资源是中文核心吗
氨基酸资源和生物资源不是中文核心
氨基酸资源和生物资源杂志创刊于1975年，不定期出版，共出版发行12期。
中文核心期刊是学术界对某类期刊的定义，一种期刊等级的划分。它的对象是，中文学术期刊。是根据期刊影响因子等诸多因素所划分的期刊。
而氨基酸资源和生物资源并不在中文核心期刊目录中，所以氨基酸资源和生物资源不是中文核心
大鲵的主要价值
娃娃鱼的背部色彩斑斓，前肢四指似人手，后肢五趾如人足，嘴边特大叫声洪亮，酷似婴儿，故名娃娃鱼，大鲵的寿命在两栖动物中是较长的，在人工饲养的条件下，可长达50～60余年，野生状态下可存活130余年，故也有人叫他“寿星鱼”，大鲵作为观赏动物历来为人民所喜爱，可使公园、动物园和游览区增加新奇的景观。
张家界将为国内最大的娃娃鱼“笨笨”申报吉尼斯世界纪录。这条取名“笨笨”的中国大鲵，2005年曾在张家界国际森林保护节上与公众见面，当时展出时长约180厘米，重约65公斤，娃娃鱼“笨笨”已近130岁的高龄，体长近2米，是迄今为止国内发现的最大娃娃鱼。
据介绍，“笨笨”是张家界白族农民王国兴1982年从邻乡群众手中收购而来，当时重约45公斤，体长约150公分。随着大鲵“笨笨”年老体弱，怕光怕人，“笨笨”被放回张家界国家大鲵自然保护区内的纯天然溶洞里生活。“笨笨”拥有方（张家界金鲵生物公司）负责人王建文说：“为唤醒国内对大鲵这种珍稀动物的保护意识，该公司决定为笨笨申报世界纪录”。王建文表示，他们将为“笨笨”申报吉尼斯动物类世界之最，相关申报材料将于2013年1月正式递交英国吉尼斯总部。 警告：国家规定大鲵（娃娃鱼）只有子二代可以进行食用和买卖，违法捕获、猎杀、贩卖、食用野生大鲵将受到法律制裁。
大鲵是一种食用价值极高的动物，其肉质细嫩、味道鲜美，含有优质蛋白质、丰富的氨基酸和微量元素，营养价值极高，被誉为“水中人参”，在中国香港、台湾及东南亚市场上被视为珍稀补品。大鲵肌肉蛋白是一种优质蛋白，必需氨基酸含量高，组成比例好，完全符合人体需要量模式。大鲵肌肉蛋白富含18种氨基酸，其中6种呈味氨基酸占氨基酸总量的42.77 %，8种人体必需氨基酸占氨基酸总量的40.72 %，必需氨基酸与非必需氨基酸比值为68.68 %，均符合FAO/WHO的理想模式；大鲵必需氨基酸评分高，符合人体需要量模式程度相当高, 其中含有丰富的我国主食中容易缺乏的赖氨酸, 可以与主食合理搭配食用, 以起到蛋白质互补作用。
大鲵蛋白与几种珍贵食物蛋白必需氨基酸质量分数的比较/mg.g⁻¹ 必需氨基酸名称大鲵蛋白质甲鱼蛋白质鲍鱼蛋白质燕窝蛋白质鱼翅蛋白质苏氨酸 45.04 43.56 11.90 76.81 41.20 缬氨酸 49.91 49.16 16.50 50.86 46.50 胱氨酸+蛋氨酸 42.00 41.70 31.98 5.86 30.30 异亮氨酸 51.12 34.85 9.45 25.95 43.90 亮氨酸 83.38 72.18 15.77 57.14 69.80 苯丙氨酸+酪氨酸 80.34 73.43 34.83 86.23 68.00 赖氨酸 89.47 79.65 10.41 43.95 68.90 色氨酸 16.43 — 10.97 0.42 9.00 此表摘自：刘绍, 孙麟, 阳爱生, 仓道平, 贾涛, 赵厚民, 廖兴华, 陈冬纯. 饲养中国大鲵氨基酸组成分析[J]. 氨基酸和生物资源, 2007, 29(4): 53-55.
大鲵肌肉中脂肪含量虽然不高，但必需脂肪酸含量高，特别是二十二碳六烯酸（DHA）含量丰富，具有与深海鱼类相似的必需脂肪酸组成和较高DHA含量的特点。大鲵脂肪中不饱和脂肪酸（UFA）高达71.13 %，其中单不饱和脂肪酸（MUFA）为42.18 %，多不饱和脂肪酸（PUFA）为28.15 %，具有保健作用的ω-6型PUFA为13.10 %，ω-3型PUFA为15.15 %，对预防心脑血管疾病具有良好的作用，是治疗烫伤、烧伤的特效药。
多不饱和脂肪酸（PUFA）是研究和开发功能性脂肪酸的主体和核心，其主要包括亚油酸（LA）、γ- 亚麻酸（GLA）、α- 亚麻酸（GLA）、花生四烯酸（AA）、二十碳五烯酸（EPA）、二十二碳六烯酸（DHA）等，其中，亚油酸及α-亚麻酸被公认为人体必需的脂肪酸（EA），在人体内可进一步衍化成具有不同功能作用的高度不饱和脂肪酸，如AA、EPA、DHA等。花生四烯酸既是人体大脑和视神经发育的重要物质, 也是前列腺素合成的前体物质。二十二碳六烯酸（DHA），俗称“脑黄金”，是一种对人体非常重要的多不饱和脂肪酸，对婴儿智力和视力发育至关重要。食用富含PUFA的鱼油具有预防心肌梗塞、心律不齐、降低血脂、动脉粥样硬化、冠状动脉硬化、抗氧化清除自由基、抗衰老等功能。
大鲵与甲鱼的重要脂肪酸含量比较/ mg.100g⁻¹ 脂肪酸名称亚油酸亚麻酸花生四稀酸二十二碳六烯酸大鲵肌肉 79.9 28.6 44.6 146.3 甲鱼肌肉 7.5 — 3.4 4.6 此表摘自：刘绍, 刘卉琳, 周治德, 彭国平, 陈冬纯, 廖兴华, 阳爱生, 仓道平. 饲养中国大鲵肝脏与肌肉中几种重要脂肪酸的测定与分析[J]. 食品与机械, 2009, 25(3): 21-26.
大鲵肌肉中富含微量元素锌, 含有一定量的硒, 大鲵软骨中含有大量钙，肝脏中含有丰富维生素，如VB1、VB2、VA、VD与尼克酸等。大鲵肌肉中锌含量相当高，是常见淡水鱼和海水鱼类的数倍。微量元素锌能够诱导金属硫蛋白（MT）的合成, 而MT能够与进入机体的有毒的重金属镉、汞、铅等结合, 从而使之失去毒性，这对处于镉、汞、铅污染地区的人们体内排铅排镉排汞具有相当积极的意义。经常食用大鲵肉能够延缓衰老，提高机体免疫力。 警告：国家规定大鲵（娃娃鱼）只有子二代可以进行食用和买卖，违法捕获、猎杀、贩卖、食用野生大鲵将受到法律制裁。
大鲵是一种传统名贵药用动物，其肌肉、内脏、骨骼、表皮及其分泌物均可入药，在历代方石中多有记载。如《本草纲目》中有“鳞目、四部、大鲵……以痴疾”。《本草经集注》、《本草拾遗》等药典中也有“治痴疾、治牛、治斑疾”的描述，表明了大鲵入药在提高智力、美容、益肤方面有显著功能。中医认为，大鲵性甘平味淡，有补气、养血、益智、滋补、强壮之功效，主治神经衰弱、贫血、痢疾、疟疾等，用于病后、产后身体虚弱，肾虚阴亏，肺痨咯血，久痢脱肛等。现代医学认为，经常食用大鲵可聪明益智延缓衰老提高造血和免疫功能，对防止心脑血管系统疾病，恶性贫血和恶性肿瘤有很好的效果。鲵皮粉拌桐油可以治疗烧伤、烫伤，尤其是对面部的烧烫伤的治疗不留疤痕。大鲵皮肤黏液细胞中释放黏糖蛋白后，与水结合即成黏液，覆盖在上皮游离面，形成了一道天然的防护屏障。黏液主要成分为黏多糖蛋白和纤维物质，还有多种激素，及“蛙皮素”，具有较强的抗菌作用，可预防麻风病、老年痴呆和防治癌症。大鲵肝脏中含有丰富的金属硫蛋白，能有效消除人体内有害的“自由基”，并可吸收外资结合有害金属离子将其排出体外，起到有效的“排毒”作用。
大鲵皮肤中含有大量活性胶原蛋白（COLLAGEN）及表皮活性变白因子（CHF），能够使人体皮肤保持弹性、润滑细腻、健康白嫩，被称为养颜美白圣品，具有极强的美容功效。
大鲵全身都是宝，是一种集保健、药用、美容为一体的珍贵物种，被专家誉为“水中人参”、“软黄金”。 体内含有50多种天然活性物，能够促进人体生理活性，改善人体生理代谢水平，促进人体蛋白质合成，提高人体免疫功能，增强抗病能力。
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