甘油菌菌种活化步骤，甘油菌怎么保存

　　回答1、LB培养基制备：准备10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化钠，加入800ml去离子水，拌匀，直至完全溶解，然后用0.2ml氢氧化钠（5mol/L）将ph调节到7.4，并加入1L去离子水，高压蒸汽灭菌。2、倒平板：培养基放置在60℃水浴锅中保温，取出后，轻轻转动培养基，让琼脂分布均匀。

　　一、甘油菌菌种活化步骤

　　1、LB培养基制备

　　（1）准备10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化钠，然后加入800ml去离子水，搅拌均匀，直至完全溶解，接着使用0.2ml的氢氧化钠（5mol/L）将ph调节到7.4左右，并加入1L的去离子水，高压蒸汽灭菌20分钟左右。

　　（2）在高压灭菌之前，应当加入15g/L（铺制平板用）或7g/L（配制顶层琼脂糖用）的琼脂糖。

　　2、倒平板

　　（1）超净台、接种环、培养皿，酒精灯等用紫外线灭菌30分钟左右。

　　（2）高压灭菌后的培养基放置在60℃的水浴锅中保温，等到溶液尚未冷却的时候，将培养基取出，轻轻转动，让琼脂均匀分布在培养基溶液中。

　　（3）等到冷却至50℃的时候，在超净台中加入抗生素，并旋转将培养基混合均匀，然后从烧瓶中倾出培养基铺制平板。

　　（4）将甘油菌冻存管放在冰上，直接用接种环在冻存管内的冰渣上蘸一下，然后涂上平板。

　　3、大量培养

　　（1）将冷藏的液态培养基重新高温高压灭菌，等到冷却至50℃的时候，加入抗生素，接着将菌落挑至已经加入抗生素的液态培养基中（2-5ml），37℃，200rpm培养8小时左右。

　　（2）按照1：500-1000的比例，将添加了抗生素的液态LB培养基稀释上一步骤所得菌液（20-25μL菌液+25ml液态LB培养基），37℃，200rpm培养12-16小时。

　　二、甘油菌怎么保存

　　1、如果是20%甘油保存菌种（甘油：菌液=20：80），一般放置在零下70℃的环境下保藏。

　　2、如果是一般细菌的菌种，在纯化后，接种在普通肉汤管中，然后经过4-6小时增菌后，放入适量甘油-生理盐水保存液，在零下20℃的环境下进行保藏。如果是链球菌属和奈瑟氏菌属的菌种，在纯化后，接种在血清肉汤管中，在5-10%CO2中经过8-10小时增菌后，加入适量甘油-生理盐水保存液，放置在零下80℃的环境下进行保藏。如果是真菌菌种，在纯化后，直接取菌洗入肉汤，加入甘油-生理盐水保存液，放置在零下20℃的环境下进行保藏。