氨基酸取代物

sars-cov-2遗传物质

2019年2019冠状病毒疾病冠状病毒大流行是由严重急性唿吸综合症冠状病毒 -2(SARS-CoV-2)引起的。这种病毒是一种人畜共患病的病原体，属于冠状病毒科贝塔科病毒属。它的大小约为30kb，是一种极具感染性的单链正义 RNA 病毒。

研究: 基于细菌的 SARS-CoV-2蛋白质-蛋白质相互作用研究。图片来源: NIAID

SARS-CoV-2蛋白的功能研究

SARS-CoV-2编码结构蛋白(穗状蛋白、包膜蛋白、膜蛋白和核衣壳蛋白)和非结构蛋白(Nsp1-Nsp16)。非结构蛋白从两个主要的开放阅读框架(ORF1a 和 ORF1b)转录而来，产生 Nsps。它还含有6种左右的辅助蛋白质，即 ORF3a、 ORF6、60 ORF7a、 ORF7b、 ORF8和 ORF10。

SARS-CoV-2的 s 蛋白的主要功能是建立病毒感染。蛋白由两个功能不同的亚基组成，S1和 S2。存在于 s 1结构域的受体结合域(RBD)与宿主细胞的血管紧张素转化酶2结构域(ACE2)相互作用，s 2结构域融合细胞膜。这样，病毒就可以进入宿主细胞。核糖体蛋白的主要功能是启动病毒复制，从而促进 RNA复制酶核糖体蛋白12的病毒 RNA 合成。

这两种结构蛋白和 Nsps 都参与了免疫逃避。在 Nsps 病例中，它抑制干扰素反应，从而帮助宿主逃避先天免疫系统。副蛋白是一类非保守的蛋白，在不同的冠状病毒种类中表达差异很大。虽然这些蛋白质的功能作用主要是未知的，但已知它们参与了对免疫反应和疾病严重程度的逃避。

SARS-CoV-2蛋白及其治疗学研究进展

迄今为止，SARS-CoV-2已在全世界夺去了485万人的生命。因此，为了保护个人免受这种病毒的感染，我们仍然需要更有效的治疗手段。为了开发 SARS-CoV-2疗法，了解病毒内和病毒-宿主蛋白-蛋白相互作用(ppi)与2019冠状病毒疾病感染有关是必不可少的。

先前的研究表明，Nsp10和 Nsp8是“细胞因子风暴”的潜在诱因。细胞因子风暴是一种失调和过度活跃的免疫反应，发生在严重的2019冠状病毒疾病疾病中，通常会导致死亡。这些研究表明，Nsp8和 Nsp10可能是药物开发的有效靶点。除了在病毒感染中的作用，RBD 还是病毒嗜性的一个关键决定因素，是 sars-cov-2中和抗体的主要靶点。

突变已经导致出现了几个 SARS-CoV-2变异已被分类为变异的兴趣(VOI)和变异的关注(VOC)。所有的变异都显示了 s 蛋白的突变，包括 RBD 区域的突变。与其他 RNA 病毒相比，SARS-CoV-2的突变率相对较低。与原始菌株相比，SARS-CoV-2挥发性有机化合物的传播性增强，毒力增强，现有疫苗和诊断的有效性降低。

一种新的细菌双杂交(B2H)体系

发展新的方法来识别和解剖的相互作用的病毒编码蛋白质是必不可少的了解基本的病毒生物学。此外，如上所述，这些也提供了一个基础的治疗进展。最近，科学家们开发了一种细菌双杂交(B2H)系统，用于研究 SARS-CoV-2在异源非真核系统中的质子泵抑制剂。本研究可在 bioRxiv * 预印本服务器上获得。简言之，B2H 系统可用于 SARS-CoV-2蛋白质组的分析。

在这项研究中，确定了十六种不同的病毒内蛋白质-蛋白质相互作用(ppi) ，涉及十六种蛋白质，并且许多最近确定的蛋白质被发现与多个伙伴相互作用。研究人员还通过他们的模型对这些相互作用进行了基因解剖，并能够识别选择性破坏性突变。因此，这个系统有助于蛋白质相互作用的遗传解剖，并发现它们的功能作用。

研究人员证明，修改后的 B2H 系统能够检测正常还原型大肠桿菌细胞质中二硫键依赖的质子泵抑制剂。此外，利用该系统研究了 RBD-ACE2突变对大鼠呼吸道细胞功能的影响。研究人员发现，循环挥发性有机化合物中的几个 RBD 氨基酸替代物干扰了 RBD-ACE2的相互作用。因此，在原则上，这个系统也可以促进识别潜在的治疗目标的相互作用病毒编码的蛋白质。

应用细菌双杂交技术研究 SARS-CoV-2的相互作用。(a)(顶部)描述了已使用的基于转录的细菌双杂交系统示意图。蛋白质分子 x (紫色)和 y (板蓝色)之间的相互作用，融合到大肠杆菌 α 亚基的 n 端结构域。大肠杆菌 RNAP (αntd)和 λci 蛋白分别稳定 RNAP 与启动子 placOL2-62的结合，从而激活 lacZ 报告基因的转录。测试启动子携带位于转录起始位点上游 -62位置的 λ 算子 OL2。(下) e。含有参与细菌双杂交系统的基因元件的大肠杆菌细胞。将染色体上的 lacZ 基因缺失，并将测试启动子和融合的 lacZ 报告基因编码在 f’episome 上。λci-y 和 αntd-x 融合蛋白编码在相容的质粒上，在 iptg 诱导的启动子控制下产生。(b) NCBI 参考基因组预测的所有已测试的 SARS-CoV-2 orf 列表(加入号: NC _ 045512.2)。每个开放阅读框的核苷酸范围是基于 NCBI 的参考基因组，连同产生的氨基酸序列长度。除穗蛋白外，所有 orf 均被克隆为全长基因。对于棘突，我们选择测试其胞外结构域(aa 16-1213)的相互作用，以避免由于其 n 端信号肽和 c 端跨膜结构域所引起的并发症。

研究的重要性

这项研究强调了利用细菌为基础的系统来研究 SARS-CoV-2编码的蛋白质之间的相互作用。B2H 是一种方便、经济的基因工具，可用于病毒性质的质子泵抑制剂的研究。根据作者的说法，这是第一个以细菌为基础的病毒相互作用组，描述了 SARS-CoV-2中十六种不同的病毒内质子泵抑制剂。此外，使用非真核系统(B2H 检测)的优点之一是缺乏桥接因子，典型地使阳性结果的解释复杂化。

蛋白质界面与两个相互作用伙伴的选择性破坏。(a)描述 SARS-CoV-1 Nsp10(淡青色)与 Nsp14(淡粉色)的配合物的晶体结构(PDB ID: 5NFY [29])。放大显示了 Nsp10(橙色、橄榄色和勃艮第色)及其相应的主要互作伙伴在 Nsp14(淡粉色)突变分析中选择的氨基酸(棒)。(b) B2H 结果显示 Nsp10取代基对其与 Nsp14和 Nsp16的相互作用有影响。在盒子中给出了 Nsp10中引入的氨基酸替代物。(c)对 SARS-CoV-2 Nsp16-Nsp10蛋白复合物(PDB ID: 6W4H [31])的晶体结构进行了描述。附加的 n 端 Nsp107-22区域由 PDB ID: 5NFY (绿色)叠加的 Nsp10结构获得。放大显示 Nsp16(橙色和紫红色)及其相应的主要互作伙伴在 Nsp10(浅青色)突变分析中选择的氨基酸(棒)。(d) B2H 结果显示 Nsp16取代基对其与 Nsp10和 Nsp15相互作用的影响。在盒子中给出了 Nsp16中引入的氨基酸替代物。(b，d)表示的 orf 与 αntd (表示为 α)或全长 λci 融合。α 和 λci 负控件分别表示全长 α 和全长 λci。柱状图显示了3个生物复制的平均值(n = 3) ，并给出了以 Miller 单位计算的 β- 半乳糖苷酶活性。错误条显示标准差。星号表示的值与 WT 有显著不同。Ns: 不显著; * : p < 0.05; * * : p < 0.01; * * * * : p < 0.0001(单因素方差分析与多重比较检验)。A 和 c 中的黑色虚线表示氢键。

这个细菌系统的一个局限是缺乏促进潜在翻译后修饰的机制，例如蛋白质磷酸化和蛋白质糖基化。

本研究表明，新发展的氧化性 B2H 报告菌株能够检测到 SARS-CoV-2脉冲 RBD-ACE2的相互作用。此外，它还可以表征的影响，几个 RBD 取代目前在循环变种。

一种新的细菌双杂交技术研究 SARS-CoV-2的相互作用,sars-cov-2遗传物质