全是酶氨基酸

谷氨酸脱氢酶催化的反应式

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第一作者：刘娜

通讯作者：朱敦明，吴洽庆，周佳海，盛翔

通讯单位：中国科学院天津工业生物技术研究所，中国科学院深圳先进技术研究院

文章DOI：10.1002/anie.202017225

关键词：生物催化，β-氨基酸脱氢酶，催化机理，蛋白质工程，不对称合成

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氨基酸脱氢酶（AADHs）催化可逆的氨基酸氧化脱氨和酮酸的还原胺化反应，由于其原子经济性，在手性氨基酸的不对称合成中具有巨大的应用潜力。然而，与广泛研究的α-AADHs相比，关于使用β-AADHs合成β-氨基酸的报道还很少。近期，科研人员对β-AADHs的晶体结构、催化机理、理性设计及合成应用展开了系统性研究。研究发现，β-AADHs家族中唯一已知成员l-赤式-3,5-二氨基己酸脱氢酶（3,5-DAHDH）的晶体结构与α-AADHs相比有很大的不同。借助于量子化学计算和定点突变实验，研究人员揭示了该酶在底物识别、催化机制方面与α-AADHs的差异。随后，通过晶体结构与催化机理指导的蛋白质理性设计，在不牺牲对映选择性的前提下，扩大了底物作用范围，获得了对多种脂肪族β-氨基酸活性提高110-800倍的突变体酶。最后，利用这些优异突变体不对称还原胺化β-酮酸高效制备了两种手性β-氨基酸（> 99% ee），分离产率为86%-87%。这些结果不仅揭示了3,5-DAHDH底物特异性的分子机理，也开辟了一条绿色的不对称合成高价值β-氨基酸的新途径。

背景介绍

手性β-氨基酸不仅是多种天然化合物中的重要组成部分，也是许多合成药物和多肽的关键结构单元，具有重要的应用价值，开发高效、绿色的合成方法已是当前的研究热点。生物催化具有反应条件温和、立体选择性高、绿色环保等多种优势。其中，β-酮酸或β-羟基羧酸及其衍生物的胺化反应是一种直接获得β-氨基酸及其衍生物的方法。例如，转氨酶可以利用有机胺供体催化β-酮酸合成光学活性的β-氨基酸，但在实际应用中，其催化效率和应用范围还有待进一步提高。鉴于α-AADHs可以催化α-酮酸不对称合成手性α-氨基酸，可以推测β-AADHs同样可以催化β-酮酸的不对称还原胺化获得手性β-氨基酸。在α-AADHs催化反应中，通过与甲酸脱氢酶偶联，不仅可以实现辅酶循环，而且其反应物甲酸铵还可以作为还原胺化反应的氨供体，具有较高的原子经济性。来自α-AADHs家族的亮氨酸脱氢酶用于l-叔亮氨酸的生产就是工业化应用的典范。

然而，目前已报道的β-AADHs只有赖氨酸降解途径中的l-赤式-3,5-二氨基己酸脱氢酶（3,5-DAHDH），且这类酶一般只对天然底物(3S,5S)-DAH具有较高活性，严重限制了其合成应用范围。在前期研究工作中，我们采用结构域逐点扫描策略对来源于Candidatus Cloacamonas acidaminovorans的3,5-DAHDHcca进行了改造及筛选，并且获得了底物谱较广的突变体（ACS Catal. 2015, 5, 2220-2224.）。然而，这些突变体的活力依然非常低。由于该酶的晶体结构未得到解析，也没有同源性较高的已知结构，突变位点如何影响底物谱及酶催化活性的分子机制也就无从得知。另外，如何在保持良好立体选择性的同时，扩大底物谱、提高酶的催化活性，省时、省力、高效地对酶分子进行改造，了解其底物识别和催化机理是非常必要的。

图文解读

1. 3,5-DAHDHcca的晶体结构

本研究获得了3,5-DAHDHcca的空晶结构、与NADPH的复合物结构及突变体E310G/A314Y?NADPH复合物结构。其单体结构由辅酶结合域和催化结构域组成，NADPH位于二者之间深的裂缝中，这与α-AADHs结构是类似的。不同的是，3,5-DAHDHcca的完整催化功能单元是同源二聚体，且活性中心恰好位于两个亚基聚合的区域（结合在A亚基上的NADPH的酰胺基团与C亚基上的E310位点形成氢键相互作用）；而已报道的α-AADHs、天然氨脱氢酶（AmDHs）均是单亚基即可完成催化反应。

图1. 3,5-DAHDHcca的晶体结构。

通过比较WT?NADPH和E310G/A314Y?NADPH结构发现，该酶的催化结构域具有很大的柔性。由于酶在反应过程中是动态的、变构的，且一般认为脱氢酶在结合底物后，辅酶结合域和催化结构域会形成“闭合”构象，以促进反应的进行。E310G/A314Y?NADPH是处于“闭合”构象的结构，即更加接近反应时的状态。图2c是处于“闭合”构象时NADPH的C4原子指示出的底物口袋。

图2. WT?NADPH与E310G/A314Y?NADPH结构间的比较，以及NADPH的C4原子指示的底物口袋。

2. 3,5-DAHDHcca的催化机理

通过量子化学计算和突变研究，进一步确证了3,5-DAHDHcca关键的底物识别位点和催化位点。理论计算推出的催化机理显示，3,5-DAHDHcca催化的氧化脱氨反应主要包括氢负离子转移形成亚胺中间体、水合中间体的形成以及C-N键断裂等步骤，这与α-AADHs的催化机理相似。目前对α-AADHs反应机理的研究有限，限速步骤还不是很清楚，但有研究表明在苯丙氨酸脱氢酶催化的反应中氢负离子转移不是氧化脱氨反应的限速步骤。而本研究中，基于量子化学计算得出的反应能垒明确指出，氢负离子转移和C-N断裂是3,5-DAHDHcca催化反应的限速步骤。本研究还发现，除了D177外，天然底物(3S,5S)-DAH的未质子化C5氨基同样可以在水合步骤中作为质子受体起到活化水分子的作用。与之相比，在α-AADHs或AmDHs中，目前研究表明仅氨基酸残基可作为反应的催化基团。这揭示了3,5-DAHDH底物特异性的分子基础，且为后期扩展该酶底物谱的分子改造工作提供了有力的指导。

图3. 3,5-DAHDHcca的催化机理

3. 3,5-DAHDHcca的分子改造与合成应用

在前期的研究工作中，已获得的突变体E310G虽然拓宽了3,5-DAHDHcca的底物谱（ACS Catal. 2015, 5, 2220-2224），但由于破坏了E310与辅酶间的相互作用，导致酰胺基团不稳定进而影响酶的催化活性。在本研究中，以(R)-β-高甲硫氨酸为模式底物，根据蛋白结构和理论计算信息对酶进行理性设计，通过重建辅酶酰胺基团与附近残基的氢键相互作用，成功获得了催化活性提高的突变体。进一步通过分子改造重塑底物口袋，提高酶与底物间的亲和力，最终获得了对(R)-β-高甲硫氨酸活力提高约200倍的突变体，这相当于野生型酶活力的1.8×104倍。底物谱测试结果表明该突变体对脂肪族底物(S)-3-氨基己酸和(S)-β-高赖氨酸也有较好的催化活性。最终，通过Novozym435水解β-酮酸酯底物获得β-酮酸，进而利用优异突变体还原胺化β-酮酸，实现了手性β-氨基酸的高效不对称合成。其中，转化154 mM底物生成(R)-β-高甲硫氨酸和(S)-3-氨基己酸的产率分别为93%和95%，ee > 99%，分离收率可达86-87%。

图4. 针对底物(R)-β-高甲硫氨酸的分子改造及突变体的相对活性

结论与展望

通过X-射线晶体学研究、量子化学计算及定点突变研究，不仅扩展了我们对β-AADHs唯一已知成员3,5-DAHDH底物结合和催化机制的理解，同时也表明了基于晶体结构和反应机理信息的理性设计策略在改造β-氨基酸脱氢酶以扩展其底物谱的潜力，为进一步合理设计新酶实现目标β-氨基酸的不对称合成奠定了坚实的基础，从而开辟了一条绿色合成β-氨基酸及其衍生物的新途径。

文献来源

Liu N, Wu L, Feng J, et al. Crystal Structures and Catalytic Mechanism of l‐erythro‐3, 5‐Diaminohexanoate Dehydrogenase and Rational Engineering for Asymmetric Synthesis of β‐Amino Acids[J]. Angewandte Chemie. DOI: 10.1002/anie.202017225

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