安捷伦氨基酸色谱柱

液相色谱过程

你们要的课堂笔记来了！

6月30号，实验与分析平台特别邀请了安捷伦资深液相应用专家陈波老师与小伙伴分享了液相色谱方法开发那些事（链接：https://zhibo.vogel.com.cn/watch/6262090），得到小伙伴们的热烈欢迎，大家强烈要求小析姐把课程内容整理成文章分享给大家，所以小析姐把当天的内容进行了汇编，分享给大家，希望对你的工作学习有所帮助。

主要内容：

1、方法开发基础；

2、选择色谱柱；

3、流动相的调节；

4、其他影响因素；

5、UHPLC方法注意；

6、参考资料。

方法开发基础理论

1、溶剂的选择

液相色谱顾名思义要使用液体作为载体，这些液体就是我们常用的溶剂，常见的溶剂有以下几种，极性由弱到强。在液相色谱分析中有一个最基本的要求就是化合物必须能溶于所使用的溶剂，所以在开发方法之前，我们要根据现有化合物的一些官能团，来查看或者推测它的溶解性，来找到能够溶解目标化合物的溶剂。

2、分离模式

了解了化合物的溶解性，还可以确定分析它使用何种分类模式，下面是一些常见化合物的所对应的不同的分离模式。

从整个图表上看，反相色谱占了很大的一个比重，世界上70%到80%的化合物都可以利用液相色谱进行分离，而在这70%到80%的化合物当中又有70%到80%的化合物是可以用反相色谱进行分离，所以，反相色谱一直是色谱分离模式中讨论的焦点。除了化合物的溶解性，我们可以根据化合物的分子量去选择合适的分离模式，可也根据下表选择具体的分离模式。

3、方法开发的目标和评价

在方法开发或者建立方法之前，会确定一个目标，对于液相色谱的方法来说，第一步，分离；第二步，分析时间；第三步，方法的耐用性。

对于分析方法的评价可以从分离、峰型、效率、重现性、耐用性和经济性6个方面进行评价。

4、方法开发中的组成要素

色谱条件中涉及的基本参数：固定相（种类、规格）、流动相（种类、比例、模式）和仪器参数（分离模块、检测模块）。

5、分离度的三个影响因素

选择性对分离影响最大，但难以预测；保留达到一定程度后几乎不再对分离度有贡献；柱效对于分离度有持续的增长作用，但效果受限制。

6、方法开发的步骤

选择色谱柱

1、完美的反相色谱柱特性

选择性是不同色谱柱对同一样品的分离差异，色谱是经验科学，选择性的优化，需要通过尝试不同键合相来实现选择性差异来自何方？主要来自键合基团本身和键合工艺。

2、根据化合物特性选择色谱柱

如果没有确定已知化合物结构类型，C18色谱柱是首选。

如果有确定已知化合物结构类型，推测所要使用的色谱条件，主要是pH，还有特殊官能团：强极性基团，酸/碱性基团，共轭结构，特征结构差异等，比如：

色谱柱的选择思路：

3、常见的两种填料颗粒类型

• 全多孔硅胶型

• 表面多孔/核壳型

相同键合基团键合技术选择性相同；全多孔填料更为常见，键合相种类更多；核壳型填料可以在较大的粒径下得到更高柱效，从而降低使用压力。

4、孔径和粒径的关系

流动相的调节和优化

1、常用流动相溶剂的特点

最常用的反相溶剂是甲醇和乙腈

• 乙腈的特点

? 有更强的偶极及π- π作用

? 洗脱能力强，可以一定程度提高分析速度

? 粘度较低，有使用更高流速的可能

• 甲醇

? 氢键作用

? 对绝大部分盐的溶解性比乙腈好

• 混合溶剂的使用

? 改变选择性

? 防止盐析出

? 避免仪器在极端比例条件下运行

• 其他可选反相溶剂：THF，IPA，乙醇

2、流动相种类对选择性的影响

两种洗脱模式

等度洗脱

? 优点：简单易重现；仪器要求低；

? 缺点：对复杂样品分离能力差；保留强的峰展宽/变形；色谱柱易污染。

梯度洗脱

? 优点：单位时间内分离能力强；适于极性相差大的混合物分离；色谱柱寿命长；

? 缺点：梯度造成基线漂移；平衡时间不足导致不重现；硬件差异影响重现性。

4、流动相添加剂种类和作用

5、反相模式下化合物保留和pH的关系

6、缓冲盐和离子强度的作用

离子强度影响化合物的解离及其与固定相的相互作用，流动相加入缓冲盐改变离子强度，改善保留、分离和色谱峰峰形。

7、缓冲液的选择

选择对填料损害小的缓冲体系

• 浓度：高浓度缓冲容量大(10－50mM)；过高浓度与有机溶剂溶解度问题；对不锈钢系统或色谱填料有损；通常甲醇体系与无机盐溶解能力较好；
• pH：考虑色谱柱及仪器的耐受范围。

常见缓冲盐的类型（小分子分析）

其他影响因素

1、温度对色谱分离的影响

2、样品溶剂对分析的影响

如何克服溶剂效应？

UHPLC方法开发的关注点

1、是否有合适的填料色谱柱？

2、色谱柱内径选择

3、方法开发中的平衡

慎重

• 分析时间长 — 效率和通量
• 流动相组成复杂 — 重现性和耐用性
• 色谱柱批间差异 — 重现性

常用的方法开发资源

色谱柱相关资源推荐：

1、HPLC column selectivity measurements

www.hplccolumns.org

2、USP Column Equivalency

https://apps.usp.org/app/USPNF/columns.html

3、缓冲液配制计算Buffer desig

nwww.bioinformatics.org/JaMBW/5/4/index.html

4、中国药典液相方法计算器

网友提问

1、夹心进样方式如何设置？普通的液相都能实现夹心进样吗？

答：在色谱工作站中，仪器方法部分可以找到进样器编程的功能，在进样器编程功能里进行设置就可以了。夹心进样是进样方式的一种，多数液相色谱仪器都能实现。

2、在分析未知样品的时候，方法开发时各个影响因素的调节顺序？

答：方法开发的一般顺序：首先，筛选流动相，其次，确定流动相梯度，最后，利用一些检测手段测定是否有共流出物。

3、梯度洗脱的规律是怎样的？

答：梯度洗脱规律是洗脱强度从弱到强，等于把保留强的化合物用更高洗脱强度加快洗出来，从而减少分析时间。

4、HPLC方法转到UPLC上面的时候应该注意什么？

答：首先建议找到选择性一致或相近的柱子，然后考虑目标柱的柱效要等于或高于HPLC柱，流动相种类和添加剂保持不变，可以用我们推荐的计算器转化一下色谱条件，最后可能流动相比例需要再微调

5、夹心进样适用于等度吗？

答：夹心进样适用于等度和梯度。

6、在分析未知样品的时候，方法开发各个因素的调节顺序怎样效率最高？哪个步骤是最重要的？

答：未知样品首先肯定是用大比例变化的梯度方法拿到保留情况，再根据结果确定下一步梯度比例使用范围，有可能的话，最好联用质谱做一些定性鉴别，可以大大减少后续工作量。

7、求氨基酸测定的柱子种类？

答：安捷伦的氨基酸分析方案是在线衍生操作，反相C18柱分离的，流动相pH偏碱，所以使用的是耐碱的色谱柱，在网站上能够查到完整方案。

8、老师，请问如果使用磷酸盐，乙腈的比例不能超过多少呢？

答：乙腈和磷酸盐混合时，根据室温不同，超过70%-75%盐就会析出，所以一定要控制比例。

9、假设标准溶液是中性，而样品溶剂pH偏高，样品目标峰会前移还是后移？原理是？

答：应该都不会移动，这时候起作用的主要是流动相pH，样品溶剂在进样后影响很小，除非进样体积很大导致干扰了色谱柱的平衡。

10、请问怎么测磷酸在DMF中的PH呢？

答：这个其实没法测定，pH值定义是在水溶液中的氢离子浓度。

11、关于水溶性很强的极性化合物，如氯代的核苷酸的各种同分异构体，如何分离？

答：核苷酸以前有用离子交换模式分离过，最近还有用HILIC模式分离，可以尝试一下。

12、请问像多环芳烃类的物质可以用液质来进行分析吗？

答：多环芳烃极性弱在ESI源难电离，用APPI可以，但液相已经有成熟的方案，灵敏度通过在线富集也可以满足要求。

13、请问老师蛋白质色谱柱如何储存？

答：不同柱子需要参考色谱柱说明书来保存的，找不到说明书可以联系生产厂商询问。

14、请问老师在样品溶剂与流动相不一致会导致峰拖尾、倒峰现象吗？样品的溶剂应该根据流动相来选择吗？

答：拖尾一般就是溶剂效应导致，样品溶剂是根据溶解性选择，并且尽量和流动相强度相近。倒峰的可能是流动相本底吸收高于样品所致，和溶剂关系不大。

15、老师，请问一下检验一个品种，流动相A泵是0.02mol/L磷酸氢二钠，B泵是甲醇，梯度方式，运行过程中经常会出现没有柱压了，能帮我们分析一下是什么情况吗？

答：建议你先排查泵的单向阀部分是否正常工作，没有柱压意味着没有流动相通过系统。

16、老师，你好。我在试方法的时候，色谱条件为C18，流动相为甲醇跟（25M磷酸二氢钾+25M磷酸氢二钾）水溶液的梯度洗脱，柱温为55℃，发现柱子的寿命会特别短，这是什么原因呢。

答：单从条件上看两个磷酸盐浓度一样的话，pH应该偏碱，在55度温度下会导致填料硅胶溶解了。

17、有机酸应该选什么SPE柱呀？

答：建议选择阴离子交换型的SPE柱。

18、DMSO可以做流动相吗？

答：可以做添加剂，但没见过只用纯DMSO。

19、请问同类相似化合物，结构上相差一个羟基，在LC上显示双峰，有什么办法可以分开吗？

答：如果是可以离子化的化合物，可以试试离子对试剂。

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（内容来源：安捷伦资深液相应用专家陈波 由小析姐整理编辑）

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