氨基酸酶(Bioresource Technology│磁性固体酸和苏氨酸醛缩酶可持续一锅化学-酶法催化生物质合成手性呋喃氨基酸)

今天推送的文章发表在Bioresource Technology上的“Sustainable one-pot chemo-enzymatic synthesis of chiral furan amino acid from biomass via magnetic solid acid and threonine aldolase”，通讯作者为江南大学生物工程学院的倪晔教授。

手性非天然氨基酸是许多重要药物合成的关键中间体或关键手性模块，因此具有很高的应用价值。其中，呋喃丝氨酸(β-(2-Furyl)serine，FS)属于杂环β-羟基-α-氨基酸，是呋喃类抗生素的成分，也是精细化工产品2-氨基-1-(2-呋喃)乙醇的前体。目前，呋喃丝氨酸主要通过化学法合成，但该过程通常会产生外消旋混合物，且需要使用大量的有机溶剂和强碱，并保持在4℃操作环境，因此，开发方便、绿色的呋喃丝氨酸合成方法是一项重要的研究课题。

糖醛是呋喃的一种醛，通常由富含半纤维素的生物质如玉米秸秆、高粱硬质秸秆和玉米芯在酸催化下水解而成。半纤维素是由木糖、阿拉伯糖等组成的天然多糖。糠醛是连接生物基产品(如糠胺和糠醇)和C5碳水化合物(主要是木糖)的关键中间体。传统的均相催化剂如无机酸(主要是H₂SO₄)可用于以水蒸气为汽提剂生产糠醛，但存在副产物多、催化剂不可回收、污染严重、能耗高等缺点。多相固体酸包括金属氧化物、Amberlyst、沸石、酸功能化MCM材料、磺化生物炭催化剂、负载型金属和杂多酸等，在糠醛生产中表现出比均相催化剂更高的活性和选择性、较低的设备腐蚀性和优异的可重复使用性。虽然多相酸可以通过过滤或离心从液相反应介质中快速分离回收，但在一锅催化反应中很难从固体木质纤维素生物质中分离出来。开发和应用磁性催化剂是解决这一问题的一条很有前途的途径。由于其独特的磁性和不溶性，磁性催化剂在外加磁场的作用下更容易分离，特别是对于固体反应混合物。因此，开发固定化木质纤维素生物质转化策略，利用磁性多相催化剂生产糠醛具有特殊的意义。

近年来，人们发现、表征了各种催化剂，并将其用于糠醛衍生物的高效制备。与传统的化学催化剂相比，生物催化剂具有催化效率高、专一性强、反应条件温和等优点。苏氨酸醛缩酶(TAs)是一类依赖吡哆醛5‘-磷酸的酶，它催化醛与甘氨酸的可逆羟醛加成反应生成β-OH-α-氨基酸，在α-和β-位有两个新的立体中心。根据α-C的立体特异性，TAs可分为L型和D型。此外，β-OH-α-氨基酸可以生成苏式和赤式两种形式。利用大肠杆菌的LTA、毛滴虫的L-allo-TA和简代木霉的L-allo-TA与甘氨酸进行羟醛加成反应合成FS。但由于糠醛对酶和微生物细胞有较强的抑制作用，上述反应的转化率均不到18%。此外，利用化学和生物催化剂将木质纤维素生物质一锅转化为FS的报道很少。

在这篇文章中，作者开发了一种有效的一锅化学–酶法将木质纤维素生物质转化为FS。合成了以玉米芯为原料制备糠醛的固体酸催化剂Fe₃O₄@MCM-41/SO₄^2-。构建了含有PpLTA(恶臭假单胞菌LTA)的大肠杆菌全细胞表达载体，并在FS合成中表现出良好的羟醛加成活性。在一锅化学–酶级联体系中，以玉米芯为原料，在Fe₃O₄@MCM-41/SO₄^2-固体酸催化下，通过串联反应和重组PpLTA细胞在温和的条件下合成了手性FS。探索了提高级联转化效率的关键反应参数。最后，对磁性固体酸和固定化细胞在一锅法中的回收利用进行了评价。

Fe₃O₄@MCM-41/SO₄^2-催化玉米芯制取糠醛

建立了糠醛的制备体系。研究了以玉米芯为原料生产糠醛的反应条件，包括催化剂负载量(0.25~5.0%，w/w)、反应温度(160~200 ^?C)和反应时间(5~180 min)。

值得注意的是，当催化剂负载量为0.25%~2.0%(w/w)时，糠醛的产率增加，而当催化剂负载量为2.0%~5.0%(w/w)时，糠醛的产率没有显著增加。因此，选择了2.0%(w/w)的催化剂负载量进行进一步研究。反应温度和反应时间是影响玉米芯降解的重要因素。首先将玉米芯中的半纤维素水解成木糖，然后用固体酸催化剂脱水生成糠醛。反应在不同的温度(160~200 min)和持续时间(5~180 min)下进行，测定了糠醛和木糖的浓度(Fig. 1).。在不同温度下，随着反应时间的延长，糠醛的产率都有增加的趋势。在一定的反应时间内，糠醛浓度在180~200℃达到最高值后，由于进一步降解，糠醛浓度逐渐下降。当反应温度为180 ℃，反应时间为40 min时，糠醛浓度最高，为72 mM。温度升高有利于较高的糠醛产率，但随着反应时间的延长，糠醛的降解速度也加快。在所有试验温度下，木糖浓度随时间呈下降趋势。较高的反应温度有利于玉米芯半纤维素的解聚和木糖的脱水。作为对照，还对固体酸Fe₃O₄@MCM-41/SO₄^2-的组成进行了研究。同时考察了Fe₃O₄@MCM-41/SO₄^2-各组分的催化效率。结果表明，Fe₃O₄@MCM-41/SO₄^2-中各组分对糠醛产生有协同作用。在相同的酸性条件下(pH 2.0)，固体酸Fe₃O₄@MCM-41/SO₄^2-的催化活性高于稀硫酸。说明Fe₃O₄@MCM-41/SO₄^2-比无机酸催化剂具有更强的催化活性组分和更高的选择性。

利用重组PpLTA细胞将糠醛转化为手性FS

生物催化具有反应条件温和、立体选择性好、环境友好等优点，已成为精细化学品不对称合成中最有前途的方法之一。本论文构建了含有PpLTA、CcLTA和SHMT三种不同酶的重组大肠杆菌，用于糠醛生物转化为手性β-(2-呋喃)丝氨酸。重组PpLTA细胞具有最高的糠醛加成活性。为了进一步提高其羟醛加成活性，利用重组PpLTA细胞分别研究了反应pH值(5.0~10.0)、反应温度(10~60 ℃)、二价金属离子(Zn²⁺, Fe²⁺, Mn²⁺, Cu²⁺, Ni²⁺, Ca²⁺, Co²⁺, Mg²⁺)、辅因子磷脂酰肌醇浓度(1~100 μM)对羟醛加成反应的影响。不含金属离子的PLP在30 ℃、pH 8.0、50 μM时，羟醛加成活性最高(Table 2)。

呋喃甲醛会对酶和微生物细胞的催化活性产生负面影响。因此，研究了大肠杆菌PpLTA全细胞生物催化剂对不同浓度(25-300 mM)糠醛的耐受性(Fig. 2a)。当糠醛浓度为25 mM和50 mM时，反应完全转化。进一步提高糠醛浓度(75-300 mM)，抑制效果明显。当电池负荷为5-20 g?L^-1时，糠醛转化率增加，而在较高的电池负荷下，糠醛转化率没有明显变化(Fig. 2b)。综合考虑产量和生物催化剂成本，选择20 g?L^-1为菌体装载量。

生物质糠醛一锅化学–酶法合成手性FS

与化学合成和酶促合成相比，化学–酶串联反应具有更高的效率和更低的成本，已被广泛应用于多种高附加值手性化合物的合成。以玉米芯为原料，磁性固体酸Fe₃O₄@MCM-41/SO₄^2-和重组大肠杆菌PpLTA为催化剂，一锅法合成了糠醛增值产品手性FS。在含100 mL水介质(pH 2.0)的200 mL聚四氟乙烯反应器中，以固体酸Fe₃O₄@MCM-41/SO₄^2-为催化剂，在180 ℃下反应40 min，将10 g玉米芯粉转化为72 mM糠醛。然后，将720 mM甘氨酸、50 μM PLP和20 g?L^-1重组大肠杆菌PpLTA加入同一反应釜中，在30 ℃和200 rpm下进行生物转化，不需要任何纯化步骤。生物转化6 h后，72 mM玉米芯衍生的糠醛转化为53 mM FS(Fig. 3)。并以相同浓度的商品糠醛生物转化为对照，其反应曲线和转化率基本一致。因此，玉米芯的化学反应体系具有良好的生物相容性，可以与生物催化合成其他有价值的氨基酸衍生物相结合。例如，生物质衍生的羰基化合物(如5-羟甲基糠醛、乙酰丙酸)可以通过这种化学–酶体系被特定的TAs催化转化为相应的有价值的ncAAs。

一锅转化后，脱除了玉米芯残渣和固体酸催化剂。然后用乙醚提取反应混合物以除去未反应的糠醛。将甲醇(400 mL)加入萃取得到的水相中，在4 ℃下孵育过夜，沉淀出大部分未反应的甘氨酸。收集沉淀的甘氨酸，用甲醇洗涤。甲醇蒸发后，残渣在pH 8.0的磷酸盐缓冲液中溶解，并加入过量的甘氨酸氧化酶(枯草芽孢杆菌168菌株，UniProt：O31616)来分解残留的甘氨酸。羟醛产物经阴离子交换树脂纯化，用0.5%醋酸水溶液洗脱。结晶固体用冷乙醇洗涤，得黄色粉末，收率37.8%。经¹HNMR(400 MHz，D₂O)δ7.56(d,J=1.8 Hz,1H)，6.53-6.46(m,2H)，5.29(d,J=4.3 Hz,1H)，4.06(d,J=4.3 Hz,1H)和¹³C NMR(101 MHz,D₂O)δ171.58,151.50,143.49,110.63,108.45,65.63,58.25鉴定为FS。

固体酸预处理玉米芯的高效糖化

反应结束后，从玉米芯残渣中分离出磁性固体酸以供进一步利用。对玉米芯残渣的化学成分进行了分析。如Table 3所示，经过固体酸预处理后，葡聚糖的含量从36%增加到46%，木聚糖的比例从17%下降到仅0.5%。半纤维素和木质素的去除率分别为98%和36%。因此，大部分木聚糖被降解，部分木质素被去除，这有利于玉米芯残渣的酶解。值得注意的是，用固体酸预处理的玉米芯得到的葡萄糖浓度明显高于未经处理的玉米芯(Fig. 4)。在40 FPU?g^?1生物质发酵条件下，预处理玉米芯48 h可获得45 g?L^-1葡萄糖，约为原料的2.5倍。此外，由于半纤维素降解为糠醛，木糖含量极低(小于2 g?L^-1)。

磁性固体酸催化剂和固定化生物催化剂的回收

催化剂的回收利用是满足绿色、可持续发展要求的关键。研究了固体酸和固定化全细胞生物催化剂在一锅法中将玉米芯转化为FS的可重复使用性。在200 mL不锈钢反应器中，将玉米芯粉(60~80目，10 g)加入含固体酸(2.0%，w/w，pH 2.0)的100 mL去离子水中混合均匀，在180 ℃ 和500 rpm下持续40 min。调节pH值至8.0后，将固定化生物催化剂加入糠醛反应器进行生物转化。生物转化在30 ℃下持续6 h。磁性固体酸在磁力作用下可以很容易地从反应体系中分离和回收，固定化细胞可以很容易地过滤回收。回收的固定化细胞用生理盐水冲洗，以进行下一批生物转化。Fe₃O₄@MCM-41/SO₄^2-固体酸用去离子水和乙醇洗涤，然后在60 ℃的烘箱中干燥过夜。回收的催化剂在焙烧前在3.0 M(NH₄)₂SO₄中再次浸渍24 h。回收的Fe₃O₄@MCM-41/SO₄^2-固体酸催化剂和固定化细胞在下一批进行评价。

为了考察Fe₃O₄@MCM-41/SO₄^2-固体酸的稳定性，采用一锅法连续使用了5个批次的催化剂。糠醛在第1批达到72 mM，第5批降至62 mM，表明固体酸催化剂可保持86%的活性，且具有稳定的回收性能。固定化细胞具有良好的重复使用性。以玉米芯为原料，回收固体酸催化剂制备糠醛，第5次转化率为62.5%，仅比第1次反应的转化率(73.6%)低11.1%。总体而言，磁性固体酸和固定化细胞在玉米芯一锅化学–酶法合成手性FS中均表现出良好的稳定性和可重用性。

在这篇文章中，作者提出了一种高效的一锅化学–酶催化合成路径，利用廉价易得的木质纤维素直接转化为呋喃丝氨酸。通过以玉米芯为起始原料，开发了一种新型的磁性固体酸（Fe₃O₄@MCM-41/SO₄^2-），以及筛选出高活性的L-苏氨酸醛缩酶重组细胞（E.coli PpLTA），构建化学–酶法级联反应体系，实现玉米芯—糠醛—呋喃丝氨酸的多步高效联产转化，最终呋喃丝氨酸产率可达73.6%， ee为99%，de为20%。另外，在一锅反应体系中探索了固体酸和重组细胞催化剂的可回收重复利用性，以提高工艺过程的可持续性和经济性。将化学合成与酶催化相结合，化学–酶级联工艺具有原料可持续性、中间体不分离、效率高、环境友好等优点，具有广泛的应用价值。

整理：孙骁

文章信息：

PMID：34098500

DOI：10.1016/j.biortech.2021.125344

文章链接：https://doi.org/10.1016/j.biortech.2021.125344